dPCR檢測
▏ 服務原理
研究PCR技術從1983年開始依次經(jīng)歷普通PCR，Real-Time PCR和dPCR，現(xiàn)如今dPCR技術的發(fā)展就像1990年代末的Real-Time PCR發(fā)展一樣，發(fā)展迅猛。
下面我們以DdPCR為例，討論dPCR技術。
什么是DdPCR? 有什么技術特征？有哪些方面的應用？
DdPCR全稱Droplet Digital PCR，引用bio-rad的描述為Droplet Digital PCR technology is a digital PCR method utilizing a water-oil emulsion droplet system. Droplets are formed in a water-oil emulsion to form the partitions that separate the template DNA molecules. The droplets serve essentially the same function as individual test tubes or wells in a plate in which the PCR reaction takes place, albeit in a much smaller format. The massive sample partitioning is a key aspect of the ddPCR technique.
從基本原理我們不難看出，DdPCR最大的優(yōu)點是絕對定量，表現(xiàn)為：
· 絕對定量 -ddPCR技術無需輸入標準曲線即可提供每個輸入樣品的目標DNA拷貝的絕對計數(shù),使該技術非常適合目標DNA的測量，病毒載量分析和微生物定量；
· 較高的精確度 – ddPCR提供的大量樣品分配功能可以可靠地測量樣品中靶DNA序列拷貝數(shù)的微小差異；
· 提高信噪比 -稀釋高拷貝模板和背景，有效富集靶標陽性分區(qū)中的模板濃度，從而可以靈敏地檢測稀有靶標，并實現(xiàn)±10％的定量精度，靈敏度可達單個核酸分子，檢測限低至0.001%；
· 消除PCR偏差 -消除qPCR的擴增效率依賴性，降低了錯誤率，可檢測到小的（1.2倍）差異，這里需要指出的是；
· 降低了耗材成本 -反應體積在皮升至納升的范圍內(nèi)，減少了試劑的使用和每個數(shù)據(jù)點所需的樣品量，對于珍貴的樣品尤其適用；
· 降低設備成本 -基于乳液的反應系統(tǒng)意味著PCR反應可以在標準的熱循環(huán)儀中進行，而無需復雜的芯片或微流體。
· 出色的分區(qū) -ddPCR技術每20 µl樣品可產(chǎn)生20,000個液滴，在96孔板上可進行近200萬個分區(qū)PCR反應，分區(qū)數(shù)量越多，精度越高。
▏ 服務應用
DdPCR技術有很多方面的應用，我們按照發(fā)表文章的領域，可以簡單劃分為：
結合腫瘤領域，我們一般與之相關的有4個領域的應用：
1. 檢測Gene Expression，主要是檢測mRNA的定量分析；
2. 檢測Mutation（SNV和Indel），可以檢測拷貝數(shù)，也可以檢測比率；
3. 檢測CNV（拷貝數(shù)變異分析），相對定量；
4. 檢測Fusion，可以檢測拷貝數(shù)，也可以檢測比率；
▏ 案例展示
科佰生物針對以上應用開發(fā)對應的檢測試劑盒，配套科佰生物的參考品，對試劑盒做性能評價，如下我們以EGFR T790M為例：
實驗一：LOB空白限測試
待測樣本：20個陰性樣本和1個NTC。分別將投入量設置為10ng和40ng，每個樣本做兩個重復進行Bio-Rad數(shù)字PCR檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：無論是10ng還是40ng，LOB控制在2拷貝以內(nèi)（一般噪音拷貝為5以內(nèi)），雜點不呈現(xiàn)劑量的依賴，是隨機產(chǎn)生的噪音信號。
實驗二：準確性測試
待測樣本：10個NGS驗證為陽性的樣本（編號1-10）; 10個NGS驗證為陰性的樣本（編號11-20）。對20個樣本分別使用數(shù)字PCR檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：
①測試10個NGS陽性樣本,檢測結果均為陽性，陽性符合率100%，并定量檢出變異頻率。
②測試10個NGS陰性樣本,檢測結果均為陰性，陰性符合率100%，定值變異頻率均為0%。
實驗三：線性范圍測試
1、投入量與拷貝數(shù)、頻率之間的線性測試
首先選取50%突變頻率的EGFR T790M標準品(CBP10402)，該標準品是通過基因編輯，二等位基因，CN=2，編輯一條為mutation，一條為WT，經(jīng)過理論值計算、Sanger測序、Bio-Rad DdPCR試劑盒（Assay ID: dHsaCP2000019）共同驗證，確認為50%的頻率。
1.1 投入量在0.1ng~200ng間設置10個梯度，進行數(shù)字PCR檢測（2復孔），分別考量FAM拷貝數(shù)與投入量是否線性相關、VIC拷貝數(shù)與投入量是否線性相關；
1.2 投入量在0.1ng~200ng間設置10個梯度，進行數(shù)字PCR檢測（2復孔），判斷是否滿足%AF=50±10%波動。
由上數(shù)據(jù)可見：
①200 ng投入量過大，拷貝數(shù)不呈現(xiàn)線性，雖然滿足45-55%范圍，但是不適合做單一通道的拷貝數(shù)判定；
②0.1 ng投入量過小，拷貝數(shù)不呈現(xiàn)線性，同時42.59%也低于45%，不適合做單一通道，也不適合做雙通道；
因此：范圍為0.5-100ng。
2、線性稀釋不同頻率理論值與檢測值的線性測試
根據(jù)以上結論，我們選取10ng作為進一步的%AF線性范圍探索，首先使用EGFR T790M的對應的陰性標準品，對50%的標準品進行有限稀釋，0.1%-50%間設置9個AF梯度，進行數(shù)字PCR檢測（2復孔）。
由上數(shù)據(jù)可見：在10ng的投入量下，AF%呈現(xiàn)非常好的線性稀釋，存在波動，但是都在誤差范圍內(nèi)。
實驗四：檢測限測試
我們可以通過理論計算來預測下可能的檢測限范圍。當控制拷貝在15000（對應50ng input）以內(nèi)時LOB數(shù)據(jù)是2，2/15000=0.0133%，預測檢測限為0.0200%。
在如此低頻的情況下，臨床適用場景適合ctDNA，一般來說臨床上10ml全血，一般中位值ctDNA是20-40ng，取最低值20ng。20ng 理論值6000個拷貝數(shù)，2/6000=0.0333%，預測檢測限為0.0500%。
0.05%的誤差范圍是±50%，就是0.025-0.075%，因此我們選擇3個點，探尋LOD分別為 0.010%、0.050%、0.100%，要求95%檢出。
0.010%
對20個0.01%的樣本進行數(shù)字PCR檢測，觀察在0.005-0.015%以內(nèi)是否達成95%檢出。
0.05%
對20個0.05%的樣本進行數(shù)字PCR檢測，觀察在0.025-0.075%以內(nèi)是否達成95%檢出。
0.1%
對20個0.1%的樣本進行數(shù)字PCR檢測，觀察在0.05-0.15%以內(nèi)是否達成95%檢出。
由上數(shù)據(jù)可見：選擇0.05%作為該檢測試劑盒的檢測限LOD。
實驗五：精密度測試
選取強陽性2%樣本20個，中陽性1%樣本20個，弱陽性0.2%樣本20個分別進行數(shù)字PCR檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：強陽性2% 、中陽性1% 、弱陽性0.2%三種檢測體系下，誤差均在合理的范圍內(nèi)，精密度良好。
實驗六：回收率測試
首先使用EGFR T790M的對應的陰性標準品，對50%的標準品進行有限稀釋，每個梯度使用陰性樣本兩倍稀釋，接著對11個樣本進行檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：當AF在0.05%-50%范圍內(nèi)，對應的回收率在80-120%范圍，符合預期。
實驗七：重復性測試
取10個不同AF（1%~50%）的標準品樣本，分別安排實驗員A、實驗員B在同一天，每人進行四次檢測。
由上數(shù)據(jù)可見：EGFR T790M檢測體系是穩(wěn)定可重復的檢出的。
實驗八：重現(xiàn)性測試
取10個不同AF（1%~50%）的標準品樣本，分別安排①實驗員A、實驗員B在同一天進行每人四次實驗測試；②實驗員A在第一天、第二天分別進行四次實驗測試；③實驗員A在第一天進行四次實驗測試，實驗員B在第二天進行四次實驗測試。
由上數(shù)據(jù)可見：EGFR T790M檢測體系是穩(wěn)定可重復的在不同人、不同時間檢出，重現(xiàn)的。
科佰生物已經(jīng)開發(fā)了多款dPCR試劑盒檢測體系，并利用自身的標準品進行了性能驗證。可用于基因突變，融合，拷貝數(shù)變異等的檢測。同時，我們可以提供dPCR檢測的科研服務，基于其絕對定值、精準定量的強大優(yōu)勢，為客戶的樣本檢測提供優(yōu)質(zhì)服務。
